Levadura y su papel en el proceso de elaboración

Levadura y su papel en el proceso de elaboración

Levadura son microorganismos eucariotas pertenecientes al reino Fungi (hongos). La primera levadura se originó hace cientos de millones de años y en actualidad se identifican más de 1500 especies que constituyen el 1% de todas las especies fungi descritas.

Anatomía

Fig. 1: Esquema simplificado de una célula de levadura.

Pared celular. La pared celular es una barrera gruesa, principalmente compuesta por carbohidratos, que envuelve la célula y protege su contenido. Hasta el 30% del peso seco de la célula está compuesto por polisacáridos, proteínas y lípidos, y alrededor de 10% de toda la proteína está presente en la pared celular. Se divide en tres capas entrecruzadas: la capa interior es una capa de quitina, compuesta en su mayor parte por glucanos; la capa exterior está compuesta principalmente por manoproteínas; y la capa intermedia es la combinación de las dos. Cada vez que una célula de levadura se clona creando una nueva célula hija, en la pared celular se forma una permanente cicatriz de gemación. Dicha cicatriz se compone de quitina, el mismo material que encontramos en los exoesqueletos de insectos. Durante un proceso de fermentación la levadura de cerveza gema pocas veces, pero en condiciones de laboratorio puede gemar hasta 50 veces. Generalmente, una célula de levadura tipo ale no gema más de 30 veces durante su ciclo de vida (en múltiples ciclos de fermentación) y en caso de levadura lager serán solo 20 veces antes de perder su capacidad de gemación.

Membrana plasmática. La membrana plasmática o membrana celular es una bicapa de lípidos ubicada entre la pared celular y el interior de la célula. Esta membrana semipermeable determina lo que entra y sale de la célula y proporciona una protección adicional contra los factores ambientales. La membrana se compone de lípidos, esteroles y proteínas, que confieren la fluidez, flexibilidad y capacidad de gemar para crear células hijas.
La levadura necesita el oxígeno molecular para formar dobles enlaces en los ácidos grasos y controlar el nivel de saturación de ácidos grasos. El nivel de saturación determina la facilidad y fuerza de los enlaces de hidrógeno que pueden formarse entre los ácidos grasos, y también determina su punto de fusión. En caso de los lípidos, el nivel de saturación controla la fuerza de enlaces de hidrógeno entre las colas hidrofóbicas de los lípidos.
La fluidez de la membrana es necesaria para que la membrana cumpla bien su función. Por su naturaleza la bicapa lipídica es fluida y esta fluidez está determinada por la fuerza de enlaces entre los lípidos. Controlando el nivel de saturación en su membrana lipídica, la levadura es capaz de mantener la fluidez adecuada de la membrana en distintas temperaturas, tales como la temperatura de fermentación elegida por un cervecero. Sin aireación correcta la levadura no es capaz de controlar la fluidez de la membrana hasta el final del proceso de fermentación, lo que provoca una parada de fermentación prematura y defectos de sabor.

Citoplasma. Todo el contenido envuelto por la membrana plasmática, excepto el núcleo, se denomina citoplasma. El fluido intracelular, conocido como citosol, es una mezcla compleja de sustancias disueltas en el agua. Entre estas las más importantes son las enzimas que participan en la fermentación anaeróbica. Estas enzimas permiten la conversión de glucosa en energía tan pronto como ésta entre en la célula. Los orgánulos especializados, como son las vacuolas, contienen proteasas. Las proteasas son unas enzimas que rompen las proteínas formadas por cadenas largas en cadenas más cortas y a veces separan los aminoácidos que necesitan. Además, dentro del citoplasma la levadura almacena el glucógeno, un carbohidrato que le sirve como reserva de energía.

Mitocondria. En la mitocondria es donde ocurre el proceso de respiración aeróbica — precisamente en su membrana doble, donde el piruvato (un compuesto metabólico) se convierte en el dióxido de carbono y agua. Incluso en las levaduras cerveceras, donde la respiración aeróbica no ocurre u ocurre de forma limitada durante la fermentación, las mitocondrias están presentes y son muy importantes para la salud de la célula. La mitocondria contiene pequeñas cantidades de ADN con los códigos para producir algunas proteínas mitocondriales. La célula produce aquí algunos esteroles y es donde ocurre la formación y utilización de Acetil-CoA (acetilcoenzima A) que es un compuesto intermedio para muchos mecanismos metabólicos. Pequeñas células mutantes — con mitocondria alterada — frecuentemente producen defectos tales como los fenoles y el diacetilo.

Vacuola. La vacuola es una estructura envuelta en una membrana donde se almacenan los nutrientes. Es también donde la célula rompe las proteínas. Las vacuolas de levaduras cerveceras son tan grandes que se pueden ver con un microscopio óptico. Sin embargo, las vacuolas anormalmente grandes pueden ser un signo de estrés.

Núcleo. El núcleo contiene el ADN de la célula y está rodeado por una membrana lipídica, similar a la membrana plasmática. Las células eucariotas, como las de levadura y de seres humanos, utilizan este orgánulo como un “centro nervioso”. El ADN dentro del núcleo almacena la información para la célula que utiliza ARNm para transferir esta información fuera al citoplasma y utilizarla en la síntesis de proteínas.

Aparato de Golgi. Aparato de Golgi es un orgánulo presente en todas las células eucariotas que es responsable de manejar las sustancias sintetizadas por la célula, modificando, ordenando y distribuyéndolas dentro de la célula. En las cisternas de Golgi se producen las modificaciones de proteínas y lípidos a transportar, que principalmente afectan los residuos de azúcar de las glucoproteínas y glucolípidos.

Retículo endoplasmático. El retículo endoplasmático es una red de membranas y es donde la célula produce habitualmente las proteínas, los lípidos y carbohidratos. En la levadura cervecera el retículo endoplasmático es muy reducido.

Metabolismo

Las células individuales de levadura no crecen mucho durante su ciclo de vida, pero sí se vuelven un poco más grandes con su envejecimiento. En general, cuando hablamos del “crecimiento de levadura”, nos referimos al proceso de producción de células nuevas. Por lo tanto si decimos que la levadura está creciendo, eso significa que la población está aumentando. La levadura puede conseguir la energía y los nutrientes necesarios para su crecimiento por varios caminos, pero algunos son más fáciles y beneficiosos para la levadura que otros. Una vez inoculada, la levadura primero gasta sus reservas de glucógeno y todo el oxígeno disponible para revitalizar sus membranas celulares y alcanzar el nivel óptimo de permeabilidad y capacidad, para luego poder transportar los nutrientes y azúcares. Las células absorben el oxígeno rápidamente y posteriormente empiezan a captar los azúcares y nutrientes presentes en el mosto. Algunos de estos compuestos pasan fácilmente por la membrana celular y otros requieren intervención de los mecanismos de transporte que la levadura tiene disponibles. Dado que algunos azúcares son más fáciles de usar para la levadura, la levadura capta los azúcares en un orden específico, empezando con los azúcares más sencillos: glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa y maltotriosa. El mosto típico contiene la maltosa en la mayor parte, así como la glucosa y maltotriosa en cantidades menores. La levadura absorbe la glucosa mediante la difusión facilitada sin gastar energía metabólica. Le resulta tan fácil utilizar la glucosa que su presencia en el mosto suprime la habilidad de usar maltosa y maltotriosa. Todas las levaduras cerveceras pueden utilizar maltosa, pero no todas tienen la misma capacidad para utilizar maltotriosa. La capacidad de utilizar distintos azúcares, las proporciones relativas de azúcares en el mosto, así como la disponibilidad de los nutrientes en el mosto determinan la mayor parte del metabolismo. Por su parte, el metabolismo determina la velocidad de fermentación y el nivel de atenuación.

Fig. 2: Azúcar, oxígeno, nitrógeno y minerales entran en la célula. Etanol, dióxido de carbono y compuestos del sabor y aroma salen fuera.

El consumo de oxígeno ocurre rápidamente — habitualmente la levadura agota el oxígeno disponible en el mosto en los 30 minutos desde la inoculación. En condiciones naturales, la levadura, como por ejemplo la presente en frutos en descomposición, tiene alta disponibilidad de oxígeno para consumir azúcares. Esto es el denominado crecimiento aeróbico, la forma más efectiva para un organismo de convertir moléculas de azúcares en energía. Pero existen periodos o entornos donde la disponibilidad de oxígeno es limitada. El consumo de azúcares en un entorno sin oxígeno provoca crecimiento anaeróbico. Louis Pasteur utilizo el término “fermentación anaeróbica” por primera vez en los años 60 del siglo XIX para describir la capacidad de la levadura para crecer en ausencia de oxígeno.

Alcohol

Una de las cosas más importantes que la levadura aporta a las bebidas fermentadas es el alcohol, y nos guste o no, hay que admitir que el ser humano en todo el mundo consume las bebidas alcohólicas por el alcohol y sus efectos sobre el organismo. De forma general, la reacción química que ocurre en este proceso se resume en la fórmula:

glucosa + 2 ADP + 2 fosfatos → 2 etanol + 2 CO₂ + 2 ATP

En esta reacción hay muchos pasos individuales, pero podemos dividirla en dos partes principales: conversión de glucosa en piruvato y posteriormente de piruvato en etanol. La primera parte es una descomposición de glucosa en dos moléculas de piruvato y la reacción es siguiente:

Glucosa + 2 ADP + 2 NAD⁺ + 2 P_i → 2 Piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H⁺

Esta reacción ocurre dentro de la célula, en el fluido denominado citosol. Las enzimas presentes en el citosol catalizan esta y otras reacciones metabólicas que la siguen. Pero el piruvato no siempre acaba convertido en etanol. De hecho, tiene dos posibles caminos a seguir: entrar en la mitocondria, donde se convierte en CO₂ y agua (respiración aeróbica), o permanecer en el citosol, donde la célula lo convierte en acetaldehído, y posteriormente en el alcohol.

¿Es mejor que se produzca agua o alcohol? La levadura prefiere no producir el alcohol y solo lo hace bajo ciertas condiciones, como por ejemplo el nivel de azúcar muy alto o el nivel de oxígeno muy bajo. La levadura consigue más energía convirtiendo el piruvato en agua y CO₂ en un ambiente con oxígeno. Para incitar la levadura a producir alcohol, necesitamos inducir la fermentación anaeróbica. La levadura prefiere respiración aeróbica porque le permite obtener el máximo de energía de una molécula de glucosa. Durante la fermentación anaeróbica, la levadura consigue solo 8% de esta energía por una molécula de glucosa. Por eso, teniendo el oxígeno disponible, la levadura puede gemar con facilidad creando más células hijas.

¿Entonces, siendo un proceso tan ineficiente, por qué la levadura produce etanol? Esto se debe a que el etanol le permite sobrevivir en un entorno anaeróbico.

La levadura cuenta con la coenzima nicotinamida adenina dinucleótido (NAD⁺ y NADH) para las reacciones de reducción-oxidación (nicotinamida adenina dinucleótido acepta o dona electrones) y también como sustrato enzimático. La levadura utiliza NAD⁺ en la fase inicial de descomposición de glucosa. Si hay oxígeno, el piruvato producido en este paso es transportado a la mitocondria, donde entra en el ciclo de Krebs. Durante el ciclo de Krebs se produce un compuesto rico en energía, denominado el adenosín trifosfato (ATP). El ATP es importante para la célula porque le asegura la energía para la síntesis de proteínas y la replicación de ADN, que son fundamentales en el crecimiento de la población. Si la célula no tiene oxígeno disponible, el piruvato producido en este paso no toma parte en el ciclo de Krebs. Por consiguiente, el piruvato se acumula, no se produce la energía (en forma de ATP) y no se produce NAD⁺. Este proceso está compuesto por varios pasos, pero lo importante es que sin NAD⁺ no se llega a la creación del piruvato y ATP. La levadura necesita recuperar el NAD⁺ y lo hace de la siguiente forma:

Fig. 3: Descarboxilación del piruvato catalizada por la enzima piruvato descarboxilasa

Fig. 4: Reducción del acetaldehído catalizada por la enzima alcohol deshidrogenasa

Mediante estas dos reacciones, el piruvato es convertido en alcohol, generando el NAD⁺ necesario.

La producción de etanol no es un escenario ideal para la levadura, pero aun así la levadura es capaz de salir adelante. El etanol producido se difunde fuera de la célula — este proceso probablemente es un mecanismo de defensa, porque el alcohol es tóxico para muchos organismos. De todas formas, si el contenido de alcohol alcanza un nivel suficientemente alto, empieza a ser tóxico para la misma levadura. Cuanto mejor es la salud de levadura, más aumenta su tolerancia al alcohol y su capacidad de terminar la fermentación.

Existe también un fenómeno que permite a la levadura fermentar de forma anaeróbica e igualmente producir etanol: el efecto Crabtree. Este efecto es muy importante durante la elaboración de cerveza. Con la concentración de glucosa suficientemente alta en el entorno, la levadura produce etanol a pesar de disponer del oxígeno. El mosto de cerveza siempre contiene más del 0,4% de glucosa necesario para que ocurra el efecto Crabtree, por lo tanto siempre obtendremos alcohol como resultado de la fermentación, incluso en la presencia del oxígeno. De hecho, la concentración de las enzimas glucolíticas es tan alta, que durante la fermentación del mosto la levadura produce ATP más rápido mediante la glucolisis que mediante la fosforilación oxidativa. El problema principal de exposición al oxígeno durante la fermentación no es la bajada del nivel de etanol obtenido, sino la activación de rutas metabólicas que producen defectos. Por ejemplo, si durante la fermentación la cerveza está expuesta al oxígeno, se produce más acetaldehído, porque es el producto de oxidación del etanol.

Floculación

La floculación es la capacidad de la levadura de aglomerarse. Es una característica importante y deseada, única para la levadura cervecera, ya que le ayuda a subir a la superficie o caer al fondo del fermentador. Cuando se acerca el final de la fermentación, las células se aglomeran en grupos de miles de células. Distintas cepas tienen diferentes características de floculación. Algunas cepas floculan más temprano y tienen tendencia a no atenuar tanto, mientras que otras no floculan tan rápido y atenúan más. La floculación temprana asegura una cerveza poco atenuada y dulce. Si la levadura no es capaz de flocular completamente, obtenemos una cerveza turbia y con sabor a levadura. La mayoría de las levaduras salvajes no floculan completamente y se mantienen en suspensión durante periodos de tiempo prolongados. En condiciones naturales, la levadura prefiere mantenerse suspendida, porque así tiene acceso a los nutrientes y azúcares. Todas las levaduras llegan a flocular con ayuda de la fuerza de gravedad, pero pueden tardar meses en hacerlo, y la mayoría de los cerveceros no puede o no quiere esperar tanto.

Esta capacidad de flocular es un resultado de la selección llevada a cabo por los cerveceros a lo largo de cientos de años. Recuperando la levadura desde el fondo o desde la superficie, la levadura que no floculaba bien se quedaba atrás. Así estas células poco floculantes perdían la posibilidad de reproducirse y quedaban excluidas de la población. Las levaduras floculantes que utilizamos hoy en día son el resultado de esta presión evolutiva.

El mecanismo de floculación todavía no es bien conocido y sigue siendo un tema de debate. El factor clave en la capacidad de las células adyacentes para agruparse es la composición de la pared celular. La levadura tiene una pared celular gruesa, compuesta de proteína y polisacáridos, y con carga superficial neta negativa debido a los fosfatos presentes en la pared celular. La magnitud de esta carga depende de la cepa de levadura, fase de crecimiento, disponibilidad del oxígeno, inanición, generación, deshidratación y edad de la célula. Las células de levadura también son hidrofóbicas debido a la exposición de péptidas hidrofóbicas. El grado de hidrofobicidad depende de la cepa de levadura, fase de crecimiento, capacidad de formar cadenas, inanición, generación, inicio de floculación y formación de fibrillas. Las paredes celulares de levaduras también contienen manoproteínas, que son proteínas con restos de manosa, y que ayudan a controlar la forma de la célula, su porosidad e interacciones con otras células, incluyendo las involucradas en el proceso de floculación.

El mayor factor determinante para la capacidad de flocular es la cepa de levadura. Cada cepa posee una secuencia de ADN única que determina el conjunto de proteínas presentes en la superficie celular. Esas minúsculas diferencias en la composición de la pared celular desempeñan el papel principal en el proceso de floculación y determinan el grado de floculación para una cepa en concreto. Los factores que influyen en el grado de floculación son la gravedad original del mosto, la temperatura de fermentación, la cantidad de levadura inoculada y la cantidad inicial del oxígeno. Hay que tener en cuenta que cualquier cosa que afecta a la salud y a la tasa de crecimiento de la levadura, también afecta la floculación.

Un factor importante en el proceso de floculación es el calcio. La levadura requiere un determinado nivel mínimo de calcio para que ocurra la floculación. Normalmente el mosto contiene una cantidad de calcio suficiente y no es necesario añadir más. En la mayoría de casos 50 ppm de calcio es suficiente para la levadura, pero en caso de utilizar agua muy blanda hay que tener este dato en cuenta.

Ésteres

Los ésteres son compuestos volátiles que se forman por la unión de ácido orgánico y alcohol. Impactan el perfil de la cerveza en gran medida, en particular en el caso de las ales. Son responsables de todos los aromas y sabores frutales que podemos encontrar en la cerveza. Los factores que afectan la producción de ésteres son: la cepa de levadura, la composición química del mosto y las condiciones de fermentación. Algunos ejemplos de sabores y aromas que aportan los ésteres son disolvente (acetato de etilo), manzana (hexanoato de etilo) y plátano (acetato de isoamilo).

Los ésteres impactan más el perfil de la cerveza que los ácidos y el alcohol por separado. El proceso de unión entre un ácido y alcohol para formar un éster lleva su tiempo, porque la levadura tiene que producir primero el alcohol. La formación de los ésteres es catalizada por las enzimas alcohol acetiltransferasas (AATasa I y AATasa II) que combinan el alcohol con un ácido activado — ácidos activados son básicamente ésteres con buen grupo saliente — y el ácido activado más abundante en el mosto es acetil-CoA. Antes de empezar la fermentación, una vez se ha aireado e inoculado la levadura, la levadura empieza a producir esteroles en preparación para gemar. La producción de esteroles gasta la acetil-CoA, lo que resulta en nivel bajo de ésteres en la cerveza. Es una de las explicaciones de los efectos que produce el oxígeno — cuanto más aireamos el mosto, menos ésteres se producen en la cerveza final.

Hay muchos otros factores que afectan la producción de ésteres, pero en general los factores que contribuyen al crecimiento de la levadura y gastan la acetil-CoA frecuentemente reducen la síntesis de ésteres. Como se ha mencionado antes, los factores que más afectan a la producción de ésteres son: la cepa de levadura, la composición química del mosto y las condiciones de fermentación. Las dependencias entre estos factores se describen más abajo en la sección “Factores que afectan la producción de ésteres y alcoholes de fusel”.

Alcoholes de fusel

La cerveza puede contener cualquier combinación de aproximadamente cuarenta alcoholes de fusel. Los alcoholes de fusel como n-propanol, alcohol isoamílico e isobutanol tienen sabor parecido a etanol, pero también pueden provocar sensación de calor al consumirlos o aportar sabore a disolvente dependiendo del tipo de alcohol y su concentración. De todos modos muchas cervezas que saben bien contienen alcoholes de fusel en cantidades por debajo o un pelín por encima del umbral de percepción, por lo tanto estos suponen un importante componente aromático derivado de la levadura. A los alcoholes de fusel también se atribuye el dolor de cabeza después de beber.

En la etapa de lag de la fermentación, la levadura empieza a formar alcoholes de fusel a partir del piruvato y la acetil-CoA durante la síntesis de aminoácidos o de la captación de aminoácidos (nitrógeno). Al final del proceso de formación de alcoholes de fusel ocurre la reoxidación de NADH a NAD+.

Factores que afectan a la producción de ésteres y alcoholes de fusel

La cepa de levadura

– Algunas cepas de levadura producen ésteres en cantidades superiores a otras cepas, en particular las cepas dedicadas a la fermentación de las cervezas de trigo y algunas cervezas belgas e inglesas.
– Se considera que las cepas para lagers producen menos ésteres que las cepas para ales, pero en este caso parece que influye más la baja temperatura de fermentación que la cepa en sí misma.
– Las cepas de alta floculación producen menos ésteres y menos alcoholes de fusel.
– La condición de la levadura también afecta a la producción de ésteres.

Composición del mosto

– Cuanto más oxígeno hay en el mosto, menos ésteres se producen, pero sube un poco la producción de alcoholes de fusel.
– Cuanto más alta es la densidad del mosto, más ésteres y alcoholes de fusel se producen.
– La suplementación del mosto con zinc (ZnSO4) y la cantidad de aminoácidos (FAN) incrementada provocan un aumento considerable en la producción de ésteres y alcoholes de fusel por la levadura.
– Los ácidos grasos, presentes en el sedimento o introducidos con los fermentables como avena, reducen la cantidad de ésteres producidos por la levadura, pero suben un poco la producción de alcoholes de fusel.
– Los azúcares simples (glucosa, fructosa, sacarosa) suben la producción de ésteres.
– Cuanto más bajo es el pH del mosto, menos ésteres y alcoholes de fusel se obtienen en el producto final.

Condiciones de fermentación

– La temperatura es uno de los factores más relevantes en la producción de ésteres y con temperatura más alta obtendremos más ésteres y alcoholes de fusel en el producto final.
– Otro factor importante es la distribución de temperaturas durante la fermentación. Se producen más ésteres cuando sembramos la levadura en mosto caliente y empezamos a bajar la temperatura. En situación contraria la producción de ésteres es menor. Este efecto no se percibe tanto en el caso de alcoholes de fusel.
– En caso de inocular con la cantidad inferior de la levadura (underpitching) sube la producción de ésteres por la levadura. Cuando se inocula con la cantidad superior a la recomendada (overpitching) la levadura produce menos ésteres y más alcoholes de fusel.
– Remover la cerveza joven/mosto al principio de la fermentación provoca un aumento en la producción de ésteres y alcoholes de fusel.
– La forma del fermentador también afecta a la producción de ésteres. En los tanques fermentadores altos y cilíndricos se producen menos ésteres que en los depósitos de fermentación bajos y abiertos.

Almacenamiento de la cerveza

– Durante el almacenamiento de la cerveza, tanto pasteurizada como sin filtrar, ocurre la descomposición de los ésteres frutales y la cerveza pierde su perfil frutal.
– Por otro lado, los ácidos orgánicos procedentes de los compuestos de lúpulo oxidados pueden crear ésteres dulces, similares en su carácter al jerez.

Bibliografía:
White, Ch., (2010). Yeast: the practical guide to beer fermentation, Boulder, Colorado, Estados Unidos: Brewers Publications.
Smart, K., (2000). Brewing Yeast Fermentation Performance 1st Edition, Hoboken, New Jersey, Estados Unidos: Wiley-Blackwell.
Boulton, Ch. y Quain D., (2001). Brewing Yeast and Fermentation. Hoboken, New Jersey, Estados Unidos: Blackwell Science Ltd.

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